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鳕鱼及其制品中裸盖鱼、油鱼和南极犬牙鱼源性成分检测 BJS 201907

发布时间:2019-04-11 13:48    来源:国家市场监督管理总局

1  范围

    本方法规定了鳕鱼及其制品中裸盖鱼(Anoplopoma fimbria)、油鱼(Lepidocybium flavobrunneum,Ruvettus pretiosus)和南极犬牙鱼(Dissostichus eleginoides,Dissostichus mawsoni)源性成分的实时荧光PCR检测方法。

    本方法适用于鳕鱼、鳕鱼片、鳕鱼扒等生鲜或速冻鳕鱼产品(不包含鱼丸、鱼糕、鱼饼、鱼肠、鱼豆腐、鱼肝油等加工产品)中裸盖鱼、油鱼和南极犬牙鱼源性成分的定性检测。

2  原理

    使用商业化DNA提取试剂盒,获得适用于实时荧光PCR检测的DNA。分别使用裸盖鱼、油鱼或南极犬牙鱼特异性引物探针,通过实时荧光PCR反应,获得Ct值,根据Ct值判断样品是否检出裸盖鱼、油鱼或南极犬牙鱼源性成分。

3  试剂和材料

    除另有规定外,本方法中所用试剂均为分析纯,水应符合GB/T 6682的一级水要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。

3.1  引物探针序列

3.1.1  裸盖鱼源性成分NADH2基因

    裸盖鱼源成分5 ’端引物:5 ’-AGGGACCACCCTAACATTCG-3 ’

    裸盖鱼源性成分3 ’端引物:5 ’-GTGGGTGGTGATGCTGTGCT-3 ’

    裸盖鱼源性成分探针:5 ’-FAM-CAGCTCTCACTGACTACTCGCATGA-BHQ1-3 ’

3.1.2  油鱼源性成分Cytb基因

    油鱼源性成分5 ’端引物:5 ’-TAACTTCGGATGACTCATCCG-3 ’

    油鱼源性成分3 ’端引物:5 ’-AGTAAAGGCCTCGTCCAATGT-3 ’ 

    油鱼源性成分探针:5 ’-FAM-CATCCGAAACCTTCATGCAAACGGC-BHQ1-3 ’

3.1.3   南极犬牙鱼源性成分CK基因

    南极犬牙鱼源性成分5 ’端引物:5 ’-CTGAATATGTAGGTGCATACG-3 ’

    南极犬牙鱼源性成分3 ’端引物:5 ’-TTGCTCTTTGTGTTTCGGTT-3 ’

    南极犬牙鱼源性成分探针:5 ’-FAM-TCCATTAGGTAAGCGAGCGGGAAGA-BHQ1-3 ’

3.1.4  内参照基因真核生物18SrRNA 

    内参照5 ’端引物:5 ’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3 ’

    内参照3 ’端引物:5 ’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3 ’

    内参照探针:5 ’-FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAAC-BHQ1-3 ’

3.2   商业化DNA提取试剂盒。

3.3   商业化PCR反应预混液。

4  仪器和设备

4.1  实时荧光PCR仪。

4.2  微量紫外分光光度计。

4.3  恒温水浴锅。

4.4  高速冷冻离心机:离心力18,000 g以上。

4.5  微量移液器(0.5 μL- 10 μL,10 μL- 100 μL,20 μL- 200 μL,100 μL- 1000 μL)。

4.6  涡旋振荡器。

4.7  天平:感量0.001 g。

5  分析步骤

5.1  样品前处理

(1)样品只有单块鱼肉组成:使用灭菌剪刀适量剪取中心部位鱼肉。

(2)样品有五块以下鱼肉组成:使用灭菌剪刀适量剪取每个组成部分的中心部位鱼肉。

(3)样品有五块以上鱼肉组成:随机挑选5块鱼肉,使用灭菌剪刀适量剪取每个组成部分的中心部位鱼肉。

    将所取得的鱼肉使用灭菌去离子水洗涤,离心去除上清液,尽可能剪碎并混匀。

    注:速冻鳕鱼产品应在完全解冻后再取样。

5.2  DNA提取

    按照商业化DNA提取试剂盒说明书中要求的取样量称取样品,每个样品设置两个平行,按照商业化DNA提取试剂盒说明书操作。

5.3  DNA浓度测定

    取1 μL DNA溶液,使用微量紫外分光光度计按照dsDNA(双链DNA)计算方式检测其浓度。

5.4  实时荧光PCR扩增

    实时荧光PCR反应体系见表1。

                          表1 实时荧光PCR反应体系

PCR预混液(2 ×

10 μL

10 μmol/L上游引物

0.4 μL

10 μmol/L下游引物

0.4 μL

10 μmol/L 探针

0.2 μL

DNA

20-50 ng

灭菌去离子水

补充至总体积20 μL

    PCR反应程序:95 ℃ 15 s; 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 34 s(读取荧光),40个循环。

5.5  实验对照

    分别设置阳性对照、阴性对照、PCR空白对照、空白提取对照各一个。

    阳性对照:含相应物种的DNA。

    阴性对照:不含相应物种的DNA。

    PCR空白对照:以灭菌去离子水替代DNA加入实时荧光PCR反应体系。

    空白提取对照:以灭菌去离子水替代样品进行DNA提取。

6  结果判断与表述

6.1  质量控制

   若以下条件的其中一条不满足要求时,结果视为无效:

   阳性对照:荧光通道出现典型的扩增曲线,相应的Ct值<30.0;

   阴性对照:Ct值≥35.0;

   PCR空白对照:Ct值≥35.0;

  空白提取对照:Ct值≥35.0;

  内参照反应:荧光通道出现典型的扩增曲线,相应的Ct值<30.0;

  样品平行反应:Ct值经6.2结果判定后应一致。

6.2  结果判定

    (1)如Ct值<30.0,且质量控制符合要求,则判定为检出相应物种源性成分。

    (2)如Ct值≥30.0,且质量控制符合要求,则判定为未检出相应物种源性成分。

6.3  结果表述

    检出 XXX 源性成分。

    未检出 XXX 源性成分。

7  防污染措施

    检测过程中放置交叉污染的措施按照GB/T 27403中的规定执行。

8 方法检出限

    裸盖鱼引物探针检出限范围为0.1 %~5 %,油鱼引物探针检出限范围为1 %~10 %,南极犬牙鱼引物探针检出限范围为1 %~2 %。

    注:因使用的设备、试剂盒不同,其检出限有所差异。


责任编辑:小雪